Электрофорез и хроматография — Методы исследования в клинической биохимии

Методы исследования химической организации клетки

Люминесцентная микроскопия.

Индукция с помощью ультрафиолетового света флуоресценции химических компонентов клетки (естественных или введенных извне).

Применяется для прижизненного выявления в клетке биохимических компонентов, способных к флуоресценции — витаминов, пигментов, гормонов, антибиотиков. Кроме того, с помощью синтетических флуорохромов, специфически взаимодействующих с определенными химическими компонентами клетки (ДНК, РНК, липидами и др.), исследуют их внутриклеточную локализацию.

Дифференциальное центрифугирование.

Центрифугирование смеси, полученной в результате разрушения клеток (ткани, органа), в специальных центрифугах при различных скоростях вращения ротора, что позволяет раздельно осаждать частицы с различной массой (ядра, оргаиеллы, макромолекулы). p>Применяется для получения чистых фракций различных субклеточных структур для последующего биохимического и биофизического исследований.

Электрофорез.

Движение заряженных частиц (макромолекул и др.), взвешенных в электролите, при наложении внешнего электрического поля; осуществляется в среде пористого наполнителя (хроматографическая бумага, гели); в зависимости от величины и знака заряда частиц они перемещаются к катоду или аноду и занимают совершенно определенное место (зону) (рис. 3.2).

Используется для разделения сложных смесей биополимеров — белков, нуклеиновых кислот и др.

Рентгеноструктурный анализ.

Основан на изучении дифракции, возникающей при взаимодействии рентгеновского излучения с кристаллическим образцом.

Рис. 3.2. Электрофореграмма смеси белков (каждому пятну соответствует определенная белковая фракция)

Применяется для исследования атомно-молекулярного строения биологических полимеров — пептидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот.

5. Хроматография. Разделение смеси веществ за счет различий в их распределении в системе, состоящей из двух компонентов — подвижного (газовая или жидкая фаза) и неподвижного (твердая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе).

Основные разновидности: жидкостная, газовая, тонкослойная хроматография.

Используется для разделения и анализа смесей веществ, а также изучения их физико-химических свойств (массы и размеров молекул и др.).

Электрофорез.

Электрофорез (от электро… и греческого рhoresis – перенесение) – направленное перемещение заряженных частиц в дисперсионной среде под действием внешнего постоянного электрического поля к противоположно заряженному электроду.

Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как

размеры (или молярная масса),

причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор пропускать электрический ток, то под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим зарядом мигрируют в направлении катода или анода. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса разделения смеси белков методом электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны или фракции, содержащие одинаковые молекулы.

Читайте также:  Геморрой или рак Развенчиваем мифы о работе кишечника Здоровая жизнь Здоровье Аргументы и Факты

Факторы, влияющие на электрофоретическую подвижность

Молекула белка в растворе при любом значении рН, отличающемся от изоэлектрической точки, имеет определенный заряд. Это приводит к тому, что белок движется в электрическом поле (макрокатион к катоду, макроанион к аноду). На электрофоретическую подвижность белковых молекул влияют следующие факторы:

Размер и форма макромолекулы.

Чем больше величина заряда белковой молекулы, тем выше ее электрофоретическая подвижность из-за увеличения силы электростатического притяжения с противоположно заряженным электродом.

Напряженность электрического поля (Н, В/м)

Характер буферного раствора

Электрофорез сыворотки крови обычно проводят при нейтральных или слабощелочных рН = 8,6, когда большинство белков мигрирует к аноду.

Чаще всего в качестве носителей используют относительно инертные вещества, но их состав все же оказывает влияние на подвижность разделяемых веществ, и, выбор носителя зависит от природы образца.

Методы электрофореза

Существует множество разновидностей и модификаций метода электрофореза, которые используются в различных областях.

Выделяют три основных типа электрофоретических систем: электрофорез с подвижной границей, зональный электрофорез и стационарный (вытесняющий) электрофорез.

Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков. В случае использования иммунологических методов для выявления разделенных белков используется иммуноэлектрофорез.

Зональный электрофорез

В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон может быть предотвращено. При этом методе разделение производят в закрепленной среде. Наиболее распространены методы разделения на пористых носителях.

Электрофорез на бумаге. Электрофорез проводят с использованием боратных, фосфатных или веронал-мединаловых буферных растворов. Носителем служит специальная хроматографическая бумага, которую разрезают на полоски требуемого размера. Наносят сыворотку крови на катодный конец смоченной буферным раствором полоски. В зависимости от типа прибора и условий опыта электрофорез на бумаге длится от 4 до 16 часов. Скорость движения белков пропорциональна величине их электрического заряда. За определенное время белковые фракции пройдут различный путь и разделятся.

Схема прибора для электрофореза на бумаге.

Затем белки фиксируют высушиванием и красят красителями. Окрашенные зоны белковых фракций вырезают и элюируют специальным растворителем (растворNaOH) для фотометрического определения каждой фракции. При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови получается до 5 фракций: альбумины, 1-, 2-, -, -глобулины.

Читайте также:  Кандидоз у детей — Into-Sana

Электрофореграмма сыворотки крови на хроматографической бумаге:

1 – альбумин, 2 – 1-глобулин, 3 – 2-глобулин, 4 – -глобулин, 5 – -глобулин.

Электрофорез на ацетатцеллюлозной мембране. Мембрана ацетатцеллюлозы как носитель для электрофореза имеет ряд преимуществ по сравнению с бумагой: однородность, строго определен­ный размер пор, пониженная адсорбционная способность, что исключает образование размытых полос позади зон. Для окрашивания зон применяют методы аналогичные методам окрашивания зон на бумаге.

Электрофорез в гелях. В этом методе в качестве опорной среды используют крахмальный, агар-агаровый, полиакриламидный гели. Характерной особенностью этой разновидности зонального электрофореза является его высокая разрешающая способность, поскольку гели функционируют как молекулярные сита: крупные молекулы проходят сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор в геле. Методом электрофореза в агаровом геле в сыворотке крови выявляется до 7-8 фракций, а при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле – до 20 фракций. Агаровый гель ввиду большого количества воды в нем и вследствие этого большой скорости движения ионов используется в иммуноэлектрофорезе для обнаружения антигенов. Самым перспективным является полиакриламидный гель, так как он прозрачен, обладает значительной механической прочностью, однороден по составу, химически инертен, размер пор у этого геля можно варьировать в широких пределах и его можно использовать с самыми различными буферными растворами. Скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе.

Фотография электрофореграмм смеси белков, разделенных в полиакриламидном геле, иллюстрирующая разделение белков по заряду и молекулярной массе.

Вариантов проведения электрофореза в полиакриламидном геле много (вертикальный в трубках и горизонтальный на пластинах).

Схема простейшего прибора для электрофореза в геле

а — до фракционирования,

б — после его окончания

Схема прибора для электрофореза в горизонтальных пластинах

1-антиконденсационная крышка;

2 – электродный резервуар;

3 — колодец для внесения препарата; 4 гель; 5 — фитиль;

6-охлаждающий столик

Вытеснительный электрофорез.

Этот метод характеризуется тем, что через некоторое время после разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся изоэлектрическое фокусирование.

Изоэлектрическое фокусирование. Это метод разделения белков, основанный на перемещении их молекул под действием постоянного электрического тока в область с величиной рН, соответствующей изоэлектрической точке данного белка. Между анодом и катодом создается градиент рН с помощью амфолитов. Каждый белок мигрирует к соответствующему электроду и прекращает движение, попадая в зону с pH = pJ (фокусируется). Таким образом, молекулы, имеющие одинаковую изоэлектриче­скую точку, сконцентрируются в узкой зоне.

Читайте также:  Что делать если у ребенка высокая температура как сбить СЕГОДНЯ

Двумерный электрофорез

  • Электрофорез двумерный — способ разделения сложных смесей белков, в котором сочетаются электрофорез белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и изоэлектрическое фокусирование. Этот метод увеличивает разрешение одномерного гель-электрофореза, а также позволяет исследовать неканонические структуры, возникающие в сверхспирализованной молекуле кольцевой ДНК. Оценить размер молекул помогут маркеры молекулярных масс. Последующая детекция на гельдокументирующих системах позволит визуализировать результат.

Реактивы для горизонтального электрофореза: агарозы, маркеры длин фрагментов ДНК, красители интеркалирующие для визуализации НК, красители для нанесения образцов на гель, буферы для электрофореза нуклеиновых кислот.

Готовые полиакриламидные гели удобны в применении, разработаны под различное количество образцов (от 1 до 26 лунок) и адаптированы к различным по размеру электрофорезным камерам. Готовые стрипы для двумерного электрофореза доступны в широком спектре диапазонов pH, длиной от 7 до 24 см.

Для автоматического препаративного электрофореза — при отделении необходимого фрагмента автоматически — используются системы препаративного электрофореза для разделения и выделения ДНК/РНК/белков серии Pippin, производства Sage Science.

Другие типы электрофореза: вертикальный, горизонтальный, капиллярный, капиллярный на чипе.

Связанные понятия

Дот-блот — техника, используемая в молекулярной биологии для детекции различных макромолекул, таких как нуклеиновые кислоты или белки. Данная техника является некоторым упрощением вестерн-блота: образцы, содержащие исследуемые макромолекулы наносятся сразу на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану, минуя стадию предварительного электрофореза в ПААГ (в частности при работе с белками).

Тканевая матрица (ТМА, tissue microarray, тканевой мастер-блок, множественно-тканный парафиновый блок ) — в медицине, парафиновый блок-реципиент в который встроены множественные тканевые цилиндры, извлеченные из стандартных парафиновых блоков-доноров и организованные в виде упорядоченной последовательности (матрицы). ТМА позволяют сохранять и использовать ценные тканевые ресурсы более эффективно и экономично для гистохимического, иммуногистохимического (ИГХ) и молекулярного исследований.

MTT-тест — колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, который имеет пурпурное окрашивание. Другие близкородственные тетразолиевые красители: XTT, MTS и WST, которые используются в связи с промежуточным.

Ссылка на основную публикацию
Экскурсия «Магия необычного
Музей-заповедник Царицыно зимой 2019 Дата: 12 Feb, 2019 Автор: Елена Рубрика: Прогулки выходного дня, Музеи Москвы Мы выбрались прогуляться по...
Школьный доклад на тему; Вши, что написать
Профилактика и меры борьбы с педикулёзом. Памятка для населения Профилактика и меры борьбы с педикулёзом Памятка для населения Педикулёз или...
Шов после кесарева сечения уход за рубцом, сколько заживает
Сколько заживает шов после кесарева сечения? При наличии определенных показаний акушер-гинеколог может принять решение извлечь ребенка посредство кесарева сечения. Такой...
Эксперт 99% рыбной продукции на Дальнем Востоке заражено паразитами — PrimaMedia
Как не заразиться паразитами через рыбу? Рыба и морепродукты содержат полноценный белок, микроэлементы, витамины, ненасыщенные жирные кислоты, необходимые для нормальной...
Adblock detector