Тема 3 Микроскопические методы исследования

Методы микроскопического исследования микроорганизмов

Светлопольная микроскопия

Светлопольная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, основной частью которого является объектив. На оправе объективов обозначается увеличение: 8, 10, 20, 40, 90.

При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей (рис. 1.12).

Изображение, получаемое в объективе, увеличивает окуляр, состоящий из двух линз. В отечественных микроскопах применяются окуляры с увеличением 7, 10, 15 (рис. 1.13). Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В микробиологии обычно используются увеличения в 900-1000 раз. Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности.

Темнопольная микроскопия

Микроскопия в темном поле зрения основана на следующем принципе (рис. 1.14). Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя: поле зрения остается темным, а объект на его фоне оказывается светящимся. Это достигается с помощью специального конденсора (параболоид) или обычного конденсора, прикрытого в центре кружком черной бумаги.

Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу «висячей» и «раздавленной» капли. При приготовлении препарата «раздавленная» капля исследуемый материал (бактериальную культуру в физиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покрывают покровным стеклом. Капля материала заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Для приготовления «висячей» капли необходимо использовать специальные предметные стекла с углублением в центре и покровные стекла.

На середину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углубления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают покровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления. Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.

Фазово-контрастная микроскопия

Фазово-контрастный конденсор представляет собой обычный объектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую получают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.

Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения.

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (рис. 1.16). Очень важно использование нефлуоресцентного иммерсионного масла.
Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.

Электронная микроскопия

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (рис. 1.17).

В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электронов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут соответственно задерживаться, что проявится на экране участками затемнения. Объект приобретает контрастность.

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ — способы изучения микроскопического строения различных объектов, размеры которых находятся за пределами разрешающей способности глаза. Микроскопические методы исследования играют важную роль в бактериологических, вирусологических, цитологических, гематологических, гистологических и других исследованиях; их применяют также в фармакологии, химии, минералогии, кристаллографии и др. Среди Микроскопических методов исследования наряду с обычной световой микроскопией широко используют стереоскопическую, темнопольную, интерференционную, фазово-контрастную, поляризационную, ультрафиолетовую, электронную микроскопию и др.

Основой для развития Микроскопических методов исследования явились работы Аббе (Е. К. Abbe) но дифракционным свойствам электромагнитного излучения. С помощью теории Аббе определяют разрешающую способность микроскопов и изготавливают линзы, лишенные хроматической и сферической аберрации, объективы, дифракционные решетки, осветительный и рисовальный аппараты.

Дифракционная решетка Аббе служит для изучения явлений дифракции и состоит из системы тонких прозрачных и непрозрачных чередующихся линий, к-рые прорезают специальным резцом в толще металлического покрытия, нанесенного на стеклянную подложку.

Осветительный аппарат Аббе применяют в микроскопах для освещения объекта в проходящем свете. Он состоит из зеркала (плоского или вогнутого) и конденсора, посредством к-рых поток света направляют в плоскость объекта в виде сходящегося пучка лучей, что обеспечивает более высокую освещенность препарата и улучшает разрешающую способность микроскопа. Конденсор состоит, как правило, из двух-трех линз; ближнюю к объективу линзу устанавливают так, чтобы ее плоская поверхность была параллельна плоскости предметного столика микроскопа. При удалении конденсора от плоскости объекта яркость освещения снижается, однако возрастает контрастность изображения.

Читайте также:  Лечение голосовых связок, как восстановить голосовые связки

Рисовальный аппарат Аббе служит для зарисовки с гистол, препаратов. Он состоит из расположенной над окуляром микроскопа системы стеклянных призм, к-рая направляет в глаз исследователя световые лучи, прошедшие через гистол, препарат и отраженные с помощью зеркала от листа бумаги, лежащей возле микроскопа. Благодаря этому наблюдатель видит совмещенное изображение препарата и своей руки, очерчивающей, напр., карандашом контуры деталей гистол, картины препарата.

При пользовании М. м. и. важное значение приобретает правильная установка освещения, к-рую обычно проводят по методу Келера. Для этого автономный осветитель, напр. ОИ-19, располагают так, чтобы плоскость ирисовой диафрагмы осветителя находилась на расстоянии 15—25 см от центра зеркала микроскопа. Затем через закрытую на 1/2—1/3 диафрагму проецируют изображение нити лампы накаливания осветителя в центр зеркала микроскопа, прикрытого для облегчения наблюдения листом белой бумаги. Изменяя расстояние между микроскопом и осветителем, производят фокусировку изображения нити накаливания и затем зеркалом микроскопа направляют изображение в его объектив. При этом величина освещенного пятна должна совпадать с диаметром апертурной диафрагмы микроскопа, резкое изображение к-рой можно получить, изменяя положение конденсора и плоскости зеркала. В заключение раскрывают апертурную диафрагму микроскопа и с помощью макро- и микровинтов микроскопа получают яркое и четкое изображение объекта.

При работе с малыми увеличениями микроскопа этот способ не всегда позволяет получить полное и равномерное освещение поля зрения. В этих случаях снимают или отводят в сторону фронтальную линзу конденсора, применяют конденсор с большим фокусным расстоянием. При широко открытой апертурной диафрагме микроскопа изображение бывает недостаточно контрастным. В процессе диафрагмирования увеличивается контрастность изображения и возрастает глубина резкости, но может снизиться разрешающая способность микроскопа за счет нарастающих при этом дифракционных явлений. При смене объектива изображение следует снова сфокусировать в фокальной плоскости при закрытой диафрагме осветителя. В случае отклонения оси осветителя от оси объектива микроскопа края изображения могут быть освещены неодинаково. Чтобы освещенность краев изображения стала одинаковой и равномерной по всей площади поля зрения, наблюдая изображение через окуляр, перемещают осветитель.

Установку освещения по методу Келера применяют также при изучении препаратов в так наз. темном поле. В этом случае заменяют обычный конденсор темнопольным и, наблюдая в окуляр, медленно поднимают конденсор до возникновения темнопольного изображения.

Объекты, изучаемые под микроскопом, могут быть прозрачными, а также непрозрачными, т. е. изменяющими амплитудные и фазовые свойства направленного на них электромагнитного излучения. В зависимости от свойств объекта изменяются физ. свойства света — цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плоскость и направление распространения волны, что используют в М. м. и. Для микроскопического исследования окрашенных объектов применяют световой микроскоп. Цвет изображения и различия в окраске нередко позволяют судить о хим. природе отдельных структур изучаемого объекта, но не дают возможности оценить его жизнедеятельность (движение, хемотаксис, слияние и др.), т.к. при окраске часто используют хим. или температурную фиксацию, убивающую биол, объект, но обеспечивающую эффективное окрашивание. В отличие от исследования фиксированных биол, объектов, витальная микроскопия основана на прижизненном окрашивании, в результате к-рого многие структуры живой клетки мало изменяются под действием специальных красителей. Витальная микроскопия может проводиться и без окрашивания, если в обычный световой микроскоп ввести темнопольный конденсор.

Самостоятельным вариантом темнопольной микроскопии (см.) является ультрамикроскопия, при к-рой мельчайшие частицы изучаемого объекта освещают боковым пучком света и на темном фоне они выглядят в виде точек. С помощью ультрамикроскопа (см.) удается измерять частицы и определять нек-рые свойства изучаемых объектов.

Для фазово-контрастной и амплитудно-контрастной микроскопии применяют микроскопы, в к-рых луч света подвергается дифракции в зависимости от особенностей изучаемого объекта; при этом изменяется длина и фаза волны света. Живые микроскопические объекты в световом микроскопе выглядят прозрачными и почти не изменяют амплитуды и цвета светового луча и вызывают лишь сдвиг фазы его волны. Лучи света, прошедшие через изучаемый объект, отклоняются от вложенной в объектив специальной полупрозрачной фазовой пластинки, и, т. о., между лучами фона и объекта возникает разность длины волны. Если эта разность достигает 1/4 длины волны, то возникает заметный для глаза эффект, когда темный объект отчетливо виден на светлом фоне или, наоборот, в зависимости от структуры фазовой пластинки (см. Фазово-контрастная микроскопия). Пластинки, изменяющие только яркость и цвет фона, используют в амплитудно-контрастном или аноптральном микроскопе. Амплитудно-контрастное устройство может быть установлено также на биол, микроскоп. Эти микроскопы значительно расширяют возможности прижизненного исследования биол, объектов без предварительной фиксации и окраски препарата.

Читайте также:  Уровень инсулина в крови норма и причины отклонения гормона

Интерференционная микроскопия построена примерно на тех же принципах, что и фазово-контрастная, но, в отличие от нее, дает возможность получать количественные данные. С помощью интерференционного микроскопа можно измерять разность фаз, вызываемую различными клеточными структурами, и определять их массу. Последовательные измерения разности фаз в двух средах с известными показателями преломления дают возможность одновременно определять толщину объекта, концентрацию сухого вещества, содержание воды и позволяют косвенным образом судить о клеточном метаболизме, проницаемости мембран, активности ферментов. Интерференционная микроскопия находит применение в цитол, исследованиях, используется для количественного анализа клеточных структур живых объектов, напр, культур тканей, простейших и т. п.

Поляризационная микроскопия основана на различном преломлении структурными компонентами клеток и тканей поляризованного света. В одних из них свет распространяется с одинаковой скоростью независимо от плоскости поляризации (изотропные структуры), в других — скорость распространения поляризованного света зависит от направления его по продольной или поперечной оси объекта (анизотропные структуры). Ряд биол, объектов (миофибриллы, мерцательные реснички и др.) имеет строгую молекулярную ориентацию, является анизотропным и обладает двойным лучепреломлением. Поляризованный свет формируют при помощи специальных поляризаторов — пленчатых поляроидов или призм Николля, к-рые помещают в микроскопе между источником света и изучаемым объектом. Образованный ими пучок плоскополяризованного света разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Один из этих лучей проходит через анизотропные структуры объекта, запаздывая относительно другого. При выходе из объекта оба луча оказываются в разных фазах. Когда показатель преломления вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, говорят о положительном двойном лучепреломлении, при обратных отношениях — об отрицательном двойном лучепреломлении. Структуры клетки, образованные ориентированными белковыми молекулами, обладают собственным положительным двойным лучепреломлением. Характер лучепреломления поляризованного света, величина анизотропии в сочетании с изменением этих оптических показателей после экстракции жирорастворителями позволяют судить о молекулярной организации структуры. Напр., в результате исследований миелиновых оболочек нервов с помощью поляризационного микроскопа было обнаружено радиальное по отношению к продольной оси нерва расположение молекул липоидных веществ и перпендикулярное по отношению к ним расположение макромолекул белка. Сходное расположение белково-липоидных элементов обнаруживается в эритроцитах и хлоропластах. С помощью поляризационного микроскопа в гаверсовых системах трубчатых костей обнаружены пластины с продольной и циркулярной ориентацией фибрилл. Кроме того, по характеру двойного лучепреломления изучают форму вирусов, белковых макромолекул и т. п.

В поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные тканевые срезы, приготовленные на замораживающем микротоме или залитые в парафин. В частности, липиды и миелин исследуют на замороженных срезах, тогда как исследование поперечнополосатой мышечной ткани и кристаллов можно производить как в парафиновых, так и замороженных срезах. Двойное лучепреломление коллагена, отчетливо проявляющееся в таких средах, как капрат целлюлозы или смолы, может полностью утрачиваться в препаратах, заключенных в смесь глицерин-желатин.

В научных и практических исследованиях широко применяют люминесцентную микроскопию (см.), для к-рой используют ультрафиолетовые лучи или сине-фиолетовую часть спектра. Нек-рые внутриклеточные образования, напр, липиды, обладают собственной (первичной) люминесценцией (см.). Другие компоненты клетки могут люминесцировать после предварительной окраски так наз. флюорохромами (см.).

Ультрафиолетовая микроскопия используется в цитол, и гистохимических исследованиях. Она позволяет изучать локализацию, количественное распределение в клетках и тканях высокомолекулярных соединений (белки, нуклеиновые кислоты) и наблюдать за их динамикой в процессе жизнедеятельности. Этот метод дает возможность без предварительной фиксации и окраски препаратов рассматривать исследуемый материал, напр., с целью прижизненного изучения микрообъектов.

Ультрафиолетовая абсорбционная микроскопия основана на способности нек-рых веществ, входящих в состав тканей и клеток, прозрачных в видимом свете, поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны.

При исследовании живых или фиксированных неокрашенных объектов возрастает контрастность изображения за счет избирательного поглощения ультрафиолетовых лучей высокомолекулярными соединениями. В частности, важное значение ультрафиолетовая микроскопия имеет для изучения распределения в клетке нуклеиновых к-т, поглощающих ультрафиолетовое излучение в участке спектра ок. 260 нм. Поглощение ультрафиолетового излучения белками зависит от входящих в их состав ароматических аминокислот (тирозина, триптофана, фенилаланина), дающих максимум поглощения в участке спектра ок. 280 нм. Для получения наглядного представления о распределении в препарате веществ изучаемый участок фотографируют в ультрафиолетовом свете с разной длиной волн. В последующем фотоснимки переснимают на цветную пленку в хромоскопе, в к-ром перед снимком, сделанным в коротковолновых лучах, помещают синий светофильтр, в лучах средней длины — зеленый и в длинноволновых лучах — красный светофильтр. Эти снимки с помощью специального приспособления совмещают на экране, и изображение становится видимым, передавая условными цветами различия поглощения ультрафиолетовых лучей отдельными структурами клетки.

Ультрафиолетовую флюоресцентную микроскопию, как и абсорбционную, используют для цитохимического изучения живых или фиксированных неокрашенных объектов, в связи с тем что спектры ультрафиолетовой флюоресценции веществ отличаются друг от друга.

Инфракрасная микроскопия дает возможность установить структуру объекта по характеру поглощения света с длиной волн 800—1000 нм. Широкое распространение имеет исследование в инфракрасном свете веществ, частично или полностью непрозрачных в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Для инфракрасной микроскопии биол, объекты не подвергают дополнительной хим. обработке. При помощи инфракрасного микроскопа производят исследование импрегнированной нервной ткани и капилляров в гистол, срезах, распознают повреждения сетчатки и радужной оболочки глаза.

Читайте также:  Шейный остеохондроз народное лечение и профилактика

Стереоскопическая микроскопия позволяет исследовать непрозрачные объекты и создает эффект объемного изображения. Ее применяют, напр., для исследования секционного, операционного и биопсийного материала, для проведения работ с помощью метода макромикроскопии (см.). В судебной медицине стереоскопическую микроскопию используют для изучения органов и тканей трупа, а также для исследования различных вещественных доказательств (см.).

Для повышения разрешающей способности М. м. и. создают оптические системы, основанные на электромагнитных линзах с применением в качестве источника излучения потока электронов, напр, для электронной микроскопии (см.) используют пучок быстрых электронов, а роль линз выполняют электрические и магнитные поля определенной конфигурации. Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая (растровая) микроскопия, к-рая дает возможность получить объемное изображение объекта за счет излучаемых им вторичных электронов.

В нек-рых микроскопах плавное, бесступенчатое увеличение без смены объектива позволяет в пределах широкого диапазона установить интересующие детали объекта, напр, динамику биол, процессов, происходящих в тканевых культурах.

Библиография:

Биофизические методы исследования, под ред. Ф. Юбера, пер. с англ., М., 1956; Де Робертис Э., Новинский В. и Саус Ф. Биология клетки, пер. с англ., с. 94, М., 1973; Дитчберн Р. Физическая оптика, пер. с англ., М., 1965; Ильин P. С., Федотов Г. И. и Федин Л. А. Лабораторные оптические приборы, М., 19 66, библиогр.; Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., с. 7, М., 1969; Скворцов Г. Е. и др. Микроскопы, Л., 1969, библиогр.

Н. К. Пермяков, Г. М. Могилевский.

Метод изучения – микроскопия на практике

Микроскопия – это изучение объектов при помощи микроскопа. Причем разными методами. Каждый из них подходит для исследования определенных видов образцов и не может использоваться для изучения сразу всех микроструктур. Профессиональный ученый умеет применять на практике все основные методы микроскопии и знает, какой микроскоп обеспечит наибольшую эффективность в исследованиях. Эта статья не сделает вас специалистом в микроскопии, но поможет лучше ориентироваться в применяемых методах.

Современные методы микроскопии

Методы исследования микрообразцов можно разделить на световые и электронные. Они, в свою очередь, подразделяются на подметоды. Давайте познакомимся с этой классификацией поближе.

Световая микроскопия использует следующие методы: светлого поля, темного поля, фазового контраста, интерференционного контраста, поляризационную микроскопию, метод исследования в свете люминесценции, метод наблюдения в инфракрасных или ультрафиолетовых лучах. Отдельно можно выделить микрофотографирование и микрокиносъемку.

К электронным методам относят просвечивающую (трансмиссионную) и сканирующую (растровую) микроскопию.

Все довольно несложно, но что кроется за этой терминологией?

Метод светлого поля – наиболее широко применяемый. При использовании проходящего света он позволяет изучать разные прозрачные образцы, например тонкие шлифы минералов, окрашенные срезы тканей животных и растений. Иногда для изучения таких образцов применяется косое освещение – оно дает более рельефное изображение. Метод светлого поля в отраженном свете нужен для исследования непрозрачных материалов, например металлов и руд.

Метод темного поля используют для изучения живых неокрашенных клеток, которые нельзя увидеть при светлопольном методе изучения (микроскопии). Он требует применения специальных темнопольных микроскопов, на которые установлены конденсоры особой конструкции.

Микроскопия в поляризационном свете – это возможность изучать минералы, шлифы сплавов и многое другое. Этот метод чаще всего используется для исследования кристаллических структур, так как он позволяет регистрировать двойное преломление лучей света, что невозможно наблюдать обычным способом. В поляризационной микроскопии тоже используются особые микроскопы – поляризационные.

К современным методам микроскопии относится и метод фазового контраста. Он нужен для наблюдения прозрачных и бесцветных объектов, в том числе и живых. К ним относятся, например, неокрашенные животные ткани, которые не видны при использовании светлопольной микроскопии. В фазово-контрастной микроскопии применяются специальные микроскопы, которые позволяют регистрировать фазовые изменения световой волны в момент ее прохождения через разные структуры рассматриваемого образца.

Флуоресцентная (люминесцентная) микроскопия основана на получении изображения образца путем приведения его атомов и молекул в возбужденное состояние. Образец облучается высокочастотным светом, что приводит к высвобождению излучения, которое пропускается через фильтр и наблюдается в оптическом диапазоне. Для наблюдений используются специальные флуоресцентные микроскопы.

К сожалению, в рамках одной небольшой статьи невозможно подробно рассмотреть все методы микроскопии для исследования материалов и микропрепаратов. Все полезные статьи на тему микроскопии вы можете найти по ссылке. Микроскопы для исследований представлены в этом разделе. Если вас интересует конкретная модель или вы не можете определиться с выбором, звоните или пишите – мы поможем!

Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.

Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.

Ссылка на основную публикацию
Тайны женского оргазма — BBC News Україна
Разнообразие женских половых губ Материалы предназначены только для читателей старше 18 лет. Малые половые губы выглядят у всех по-разному. Нет...
Таблетки Пантопразол инструкция по применению, цена, аналоги и отзывы
Пантопразол: инструкция по применению и для чего он нужен, цена, отзывы, аналоги Пантопразол — ингибитор H-K-АТФ-азы. Обеспечивает блокаду заключительной стадии...
Таблетки при панкреатите какие препараты и средства применяют при лечении панкреатита
Какие лекарства принимать когда болит поджелудочная железа и чем обезболить Если болит поджелудочная железа, какие лекарства принимать, — непростой вопрос....
Тайсона не включили в Топ-10
Звезды Персоналии Вера Алентова город Котлас Архангельской области Народная артистка России Вера Алентова – одна из самых любимых актрис отечественного...
Adblock detector